抽象的な

導入

COVID-19は、コロナウイルス科に属するエンベロープを持つプラス鎖一本鎖RNAウイルスによって引き起こされる新たなパンデミック疾患であり、2019年11月から12月に中国の武漢で初めて特定されました（Phelan et al., 2020 ）。国際ウイルス分類委員会は、この新しいコロナウイルスを重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）と命名し、症状が肺炎に似ていることから、世界保健機関（WHO）は2020年2月11日にCOVID-19と指定しました（Dai et al., 2020 ; 世界保健機関（WHO）、 2020 ）。この疾患は急速に広がり、世界中の212以上の国と地域を覆い、WHOによって世界的な健康上の緊急事態が宣言されました。全世界で、COVID-19の確認症例は47,930,397件で、うち死亡者は1,221,781人とWHOに報告されている（2020年11月5日）。新型コロナウイルスSARS-CoV-2はコウモリコロナウイルスと96.2％同一であり、遺伝子構成の点で2002年のSARS-CoVと大きな同一性（79.5％）を共有しており、親和性は高いものの、ほぼ同じメカニズムで宿主細胞に侵入する。両ウイルスは、ウイルススパイク糖タンパク質S1が宿主受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）に結合することで宿主の体内に侵入する。コロナウイルスの中で魅力的な薬物ターゲットは、約306アミノ酸長の主要プロテアーゼ（Mpro、3CLpro）であり、ウイルスポリタンパク質の切断を抑制することで病気の蔓延を予防する。 Mpro は、ウイルスの機能タンパク質のタンパク質分解活性化につながるポリタンパク質の処理に不可欠です (Zhang et al., 2020 )。ウイルスの侵入を標的とすることは、ウイルスのライフサイクルの後期段階を阻害するよりも優れた利点があります。

今のところ、COVID-19パンデミックの予防と治療に臨床的に効果が実証された特定のワクチンや抗ウイルス薬はありません。状況の重大さとSARS-CoV-2の急速な世界的拡大を考えると、治療薬と新しい予防法を見つけるには、研究者による緊急かつ補完的な取り組みが必要です。ヒドロキシクロロキン、アルビドール、レムデシビル、ファビピラビルなどの薬は現在、COVID-19治療における有効性と安全性をテストするための臨床試験が行われており、これまでに有望な結果が得られています（Aanouz et al., 2020 ; Dong et al., 2020 ; Boopathi et al., 2020 ）。最近、保健家族福祉省（MHFW）傘下のインド医学研究評議会は、COVID-19の疑いまたは確定診断を受けたCOVID-19患者の治療に直接携わる無症状の医療従事者に対する化学予防として、ヒドロキシクロロキン（1日目に400 mgを2回、その後は400 mgを週1回）の使用を提案した。インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、マウス白血病ウイルス、植物ウイルス、エプスタイン・バーウイルスなど、いくつかのヒトウイルスに対するコルジセピンの強力な抗ウイルス活性を考慮して（Chanda et al., 2015 ; Ohta et al., 2007 ; Ryu et al., 2014 ）、 in silicoアプローチを使用してSARS-CoV-2に対する阻害能を評価することが検討された。

スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）と主要プロテアーゼは、ウイルスの感染、複製、宿主体内での増殖に重要な役割を果たすことは明らかです（Wang et al., 2020 ; Wrapp et al., 2020 ; Zhang et al., 2020 ）。したがって、本研究では、計算手法を使用して、コルジセピンとの分子相互作用シミュレーション中にこれらのタンパク質ターゲットが利用されました。本論文は、コルジセピンの治療の可能性を強調しており、したがって、薬物の再利用がSARS-CoV-2に対する薬物開発のより効果的な方法であることを世界社会に示唆しています。

材料と方法

結果と考察

真菌類Cordyceps militarisからは、いくつかの薬理活性化合物が報告されています。その中でも、コルジセピンは、その広範囲の細胞および生物学的作用により、さらに注目を集めています (Tuli et al., 2014 )。プリン生合成、DNA/RNA、mTOR (哺乳類ラパマイシン標的タンパク質) シグナル伝達経路など、さまざまな生化学物質や分子プロセスを制御することが知られています (Holbein et al., 2009 )。コルジセピンとその関連類似体は、抗がん、抗ウイルス、抗酸化、抗炎症、抗菌活性に加えて、肝臓、腎臓、心血管、呼吸器、神経、性、免疫系に対する作用を含む、顕著な臨床的健康効果 (Liu et al., 2015 ) を持っています (Tuli et al., 2014 )。コルジセピンとその類似体は、さまざまな病気を引き起こすヒトウイルスに対して強力な抗ウイルス活性を示すことが報告されています（Chanda et al., 2015 ; Ohta et al., 2007 ; Ryu et al., 2014 ）。

SARS-CoV-2 の大きな膜貫通スパイク糖タンパク質 (I 型) は、その顕著な特徴の原因であり、高度にグリコシル化されています (Wrapp et al., 2020 )。しかし、このウイルスと他のいくつかのウイルスは、内因性宿主タンパク質のグリコシル化に適切かつ類似したグリカンコートを獲得してグリカンシールドとして機能することが示唆されており、非自己ウイルスペプチドを自己グリカンでマスキングすることで免疫回避を促進します (Watanabe, Allen et al., 2020 ; Watanabe, Berndsen et al., 2020 )。ウイルスタンパク質は通常、3 つの異なる経路のいずれかを介してグリコシル化されます。これらのプロセスは、関与する細胞酵素が異なるだけでなく、さまざまな形態のグリカン構造を生成します (Sugrue, 2007 )。結果として生じるグリカンは、N 結合型、O 結合型、またはグリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカー型のいずれかです。N 結合型グリコシル化は、Asn-X-Ser/Thr アミノ酸配列が存在するタンパク質部位で発生します。O 結合型グリカンは、通常、セリンまたはスレオニン残基によって鎖に結合されます。場合によっては、糖タンパク質は脂質結合を介して脂質膜に結合され、このタイプの修飾はグリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカーと呼ばれることがよくあります (Sugrue、 2007 )。

SARS-CoV-2 スパイク糖タンパク質は、受容体結合サブユニット (S1) と膜融合サブユニット (S2) の 2 つのサブユニットで構成されています (Lu et al., 2020 ; Zhou et al., 2020 L)。スパイク糖タンパク質は安定したホモ三量体に組み立てられ、N 結合型糖化 (Asn-X-Ser/Thr、X はプロリン以外の任意のアミノ酸) のための 66 個の標準的なシークオンと、多数の潜在的な O 結合型糖化部位を有します (Watanabe, Allen et al., 2020 ; Watanabe, Berndsen et al., 2020 )。興味深いことに、コロナウイルスのウイルス粒子は小胞体ゴルジ体中間体（ERGIC）の内腔に出芽し、ウイルス表面の糖タンパク質が分泌経路を通過する際にどのように処理されるのかという正確なメカニズムに関する未解決の疑問が生じています（Stertz et al., 2007 ; Zhao et al., 2020 ）。

多くのウイルスと同様に、SARS-CoV-2 はスパイク糖タンパク質三量体を利用して宿主細胞表面受容体アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 糖タンパク質を認識して結合し、宿主細胞への侵入を促進します (Watanabe et al., 2019 )。ウイルススパイクタンパク質がウイルス表面での位置とともに宿主細胞を標的にして侵入する上で重要であることから、スパイクタンパク質は中和抗体を生成するためのワクチンの免疫原としてよく使用され、宿主受容体結合や膜融合を阻害する可能性のある小分子による阻害の標的となることもよくあります (Li, 2016 ; Watanabe et al., 2019 )。したがって、ウイルススパイク三量体の糖化パターンを理解することは、このような感染症の有効なワクチン、中和抗体、治療阻害剤の開発に不可欠です。

分子相互作用研究により、コルジセピンはSARS-CoV-2のスパイクタンパク質のRBDドメインと強い結合親和性（-145.3）を持つことが明らかになりました（ 図1 ）。コルジセピンは、RBDドメイン-ヒトACE2界面でAsn33、His34、Lys353と化学相互作用（水素結合）を示しています（ 図1 ）。これらすべてのアミノ酸は、スパイク糖タンパク質と宿主受容体の界面領域に局在し、最終的に一次感染中に受容体を介したエンドサイトーシスを促進することは注目に値します（Hoffmann et al.、 2020 ）。最近の研究では、スパイクタンパク質を標的とする汎コロナウイルス融合阻害剤（EK1C4）が、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、SARSr-CoVなどの多くのコロナウイルスにおいて、宿主の体内へのウイルスの侵入を効果的に制限した（IC ₅₀範囲：1.3〜15.8 nM）ことが報告されています（Xia et al.、 2020 ）。

図1.

コルジセピンのドッキング構造と化学的相互作用は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質 RBD の結合部位におけるリガンド原子および相互作用するアミノ酸とともに示されています。

コロナウイルスのスパイクタンパク質以外の興味深い薬物ターゲットは、ウイルスポリタンパク質の切断を抑制することで病気の蔓延を防ぐ、約306アミノ酸長の主なプロテアーゼ（Mpro、3CLpro）です。Mproは、SARS-CoV-2のウイルス機能タンパク質のタンパク質分解活性化につながるポリタンパク質の処理に不可欠です（Zhang et al.、 2020 ）。コンピューターによる解析により、コルジセピンはMproと強く結合する（相互作用スコア：-180.5）ことが明らかになりました（ 図2 ）。Mpro活性部位のアミノ酸、例えばThr26、Gly143、Cys145、Ser144、Leu141、His172、Phe140、Glu166、His163、His164は、コルジセピンとの化学的相互作用において重要な役割を果たします（ 図2 ）。

図2.

コルジセピンのドッキング構造と化学的相互作用は、M ^proの結合部位におけるリガンド原子および相互作用するアミノ酸とともに示されています。

生体内の小分子の生物学的反応は、主に相互作用パートナーによって制御されています (Sharan et al., 2007 )。コンピューター支援医薬品設計 (CADD) では、疾患が特定の経路のタンパク質複合体の変化に反映されることが多いため、相互作用ネットワークの役割がさらに重要になります (Gollapalli et al., 2020 ; Oti et al., 2006 )。コルジセピン-タンパク質ネットワークデータにより、コルジセピンはアポトーシス、がん、B型肝炎、結核、A型インフルエンザ、単純ヘルペス感染など、さまざまな経路を調節できることが明らかになりました。統計的に有意なコルジセピン-タンパク質ネットワークは、単純ヘルペス感染 (0.000562) と関連していることがわかりました: CASP3 および CASP8。 B型肝炎（2.38e-10）：CASP3、CASP8、CASP9、MYC、TLR4、結核（9.08e-10）：CASP3、CASP8、CASP9、IL10、TLR4（ 図3 ）。

図3.

コルジセピンの相互作用ネットワークは STITCH アルゴリズムによって決定され、複数の経路におけるコルジセピンの関与を示しています。これは信頼性ビューです。より強い関連性は太い線で表されます。タンパク質間相互作用は...

ポリアデニル化は、RNAをエキソヌクレアーゼによる分解から保護することで、ポリアデニル化された転写産物の半減期を延ばす、すべてのウイルスに共通する重要なプロセスです（Ustyantsev et al., 2020 ）。3'末端のポリアデニル化は、COVID-19でも報告されており、病原性とウイルスの増殖に大きな役割を果たしています。SARS-CoV-2のゲノム複製中、ゲノムの完全長（-）RNAコピーが合成され、不連続な転写によってすべての構造タンパク質が生成されます（Hoffmann et al., 2020 ; Luk et al., 2019 ）。その後、ウイルスのヌクレオカプシドは、ゲノムRNAとRタンパク質とともに細胞質内で結合し、小胞体の腔に送られます。その後、ウイルス粒子は感染した肺組織からエキソサイトーシスによって放出され、腎細胞、肝細胞、腸、Tリンパ球などの他の標的組織や下気道のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体に結合し、免疫系の崩壊を含む主な症状と徴候を形成します（Lambeir et al., 2003 ; Wrapp et al., 2020 ; Yan et al., 2020 ）。この文脈では、 Cordyceps militarisの生理活性化合物であるコルジセピン（3'-デオキシアデノシン）が、SARS-CoV-2の複製を制御するのに有効であると考えられています。コルジセピンは、リボース部分に3'ヒドロキシル基が欠けていることを除いて、アデノシンと構造的に類似しています。コルジセピンはアデノシンと構造的に類似しているため、一部の酵素は両者を区別できません。そのため、ポリ(A)ポリメラーゼ阻害、ポリ(A)テールの短縮、mRNAの不安定化、プリン生合成阻害（ 図4 ）などの特定の生化学反応に関与し、タンパク質合成の早期終了をもたらす可能性があります（Holbein et al., 2009 ; Overgaard-Hansen, 1964 ）。この研究は、COVID-19に対するコルジセピンの治療可能性を強調した最初の研究です。ただし、いくつかの研究グループは、コルジセピンがインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、マウス白血病ウイルス、植物ウイルス、エプスタイン・バーウイルスなど、いくつかのウイルスに対して抗ウイルス活性を持つことも報告しています（Ohta et al., 2007 ; Ryu et al., 2014 ）。冬虫夏草は肺や腎臓の強壮剤として、また慢性気管支炎、喘息、結核、その他の呼吸器系の疾患の治療に長い歴史をもって使用されています (Tuli et al., 2014 )。シッキムの民間療法士は、がん、喘息、結核、糖尿病、咳や風邪、勃起不全、女性のBHP、肝炎など21種類の病気の治療に冬虫夏草を使用しています (Panda & Swain, 2011 )。内生菌類であるEmericella nidulans由来のコルジセピンには、 HCV NS3/4Aプロテアーゼ阻害特性があると報告されています (Hawas et al., 2012 ; Suwannarach et al., 2020 )。高濃度のコルジセピンは、インフルエンザウイルスのゲノム複製を選択的に阻害します (Pridgen, 1976 )。別の研究では、コルジセピン類似体が精製HIV-1逆転写酵素を阻害することが報告されている（Ryu et al., 2014 ）。タバコモザイクウイルスおよびササゲクロロティックモットルウイルスレプリカーゼのin vitro RNA合成は、高濃度のコルジセピンによって阻害される。さらに、EBV誘導性ヒトリンパ球形質転換は、インターフェロンの非存在下でコルジセピンによって阻害される（Ryu et al., 2014 ）。コルジセピンが抗ウイルス活性を発揮する分子メカニズムはまだ明らかにされていない。しかし、腎機能および肝機能、免疫調節関連抗腫瘍活性、ポリ（A）ポリメラーゼ阻害、ポリ（A）テールの短縮、mRNAの不安定化、プリン生合成阻害に対するその効果は最も有望であり、さらなる注目に値する。

図4.

コルジセピンはSARS-CoV-2 RNA分解に対する生物学的反応を媒介する。

結論

このように、報告されているポリアデニル化阻害に加えて、コルジセピンとSARS-CoV-2スパイクタンパク質および主要プロテアーゼとの強力な分子相互作用に基づくと、コルジセピンが宿主の体内へのウイルスの侵入と複製を阻害する可能性が高いことが示唆されます。したがって、世界社会はCOVID-19治療の有効性と安全性をテストするために、再利用臨床研究を行うべきであることが示唆されており、これは今緊急に必要とされています。さらに、肝臓、腎臓、心血管、呼吸器、神経、免疫系に対する保護作用を含むコルジセピンの顕著な臨床的健康効果、さらに抗癌、抗酸化、抗炎症、抗菌作用も本研究を裏付けています。なぜなら、これらの組織は感染後期にCOVID-19の影響を最も受けるからです。

著者の貢献

研究デザイン、データ収集、データ分析、および論文執筆は AK Verma によって行われました。

謝辞

記事情報